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Service de Microséquençage de la plateforme PISSARO :

Microsequenceur

Installé au sein du laboratoire "Polymères, Biopolymères, Surfaces" UMR 6270 CNRS sur le campus de la Faculté des Sciences de Mont-Saint-Aignan, notre service est spécialisé dans la détermination de séquences en acides aminés de protéines ou de chaînes peptidiques et propose également les différents services relatifs à l'analyse protéomique (électophorèse 2D, Electro-Blotting, Electro-Elution, Digestion trypsique et analyse MALDI-TOF, etc...). Commun à l'Institut de Recherche en Innovation Biomédicale, il est majoritairement utilisé par les chercheurs de tous les laboratoires de l'IRIB mais est également ouvert sur l'extérieur.



Méthode de détermination de la séquence en acides aminés:

degradation d'Edman

L'identification de la séquence d'une protéine ou d'un peptide est réalisée à l'aide du microséquenceur automatique Procise Protein Sequencing System Model 494 connecté à un analyseur d'acides aminés-PTH Model 140 de Perkin Elmer Applied Biosystems. Le procédé chimique utilisé pour déterminer la séquence d'acides aminés est basé sur la dégradation d'Edman. Le microséquenceur est composé de 3 parties bien distinctes (cartouches, chambre de conversion et colonne HPLC en phase inverse) dans lesquelles se déroulent les différentes étapes de la dégradation. La protéine d'intérêt est déposée dans une des cartouches (1) où débute la dégradation.

MicroSéquenceur

Il s'y produit tout d'abord le couplage de la protéine avec le PITC (PhénylIsoThiocyanate) dans des conditions basiques pour former le dérivé PTC-protéine (PhénylThioCarbamyl-protéine). Le TFA (l'acide TriFluoroAcetic) clive ensuite le premier acide aminé sous forme de dérivé acide aminé-ATZ (AnilinoThioZolinone) et libère l'extrémité N-terminale pour le prochain cycle de dégradation. . L'acide aminé-ATZ est ensuite transféré dans la chambre de conversion (2) dans laquelle il est converti en acide aminé-PTH (PhenylThioHydantoin). Cet acide aminé-PTH est injecté dans une colonne HPLC phase inverse greffée en C18 (3) et détecté à 269 nm. Son temps de rétention est alors comparé à celui obtenu avec des acides aminés-PTH standard et ainsi de suite pour les résidus acides aminés suivants résultant de la dégradation. Il est à noter que des difficultés d'identification surviennent avec les résidus tryptophane et cystèine qui sont difficilement détectables. Néanmoins, un échantillon de quantitè raisonnable (30 pmoles) permet de soupçonner la présence de ces résidus dans une séquence. Si l'échantillon est relativement pur, non bloqué en Nt et de concentration de l'ordre de 10 pmoles, la détermination de la séquence N-terminale est relativement aisée. Une fois la séquence déterminée, notre service réalise une recherche dans les bases de données par le biais des outils bio-informatiques.



Préparation des échantillons:

Les séquences sont majoritairement déterminées à partir de protéines "électro-blottées" sur une membrane de PVDF (PolyVinylDiFluoride) et colorées au rouge Ponceau ou au bleu de Coomassie. Cependant, il est possible de travailler à partir d'un spot ou d'une bande protéique sur gel. Après excision du morceau de gel d'acrylamide contenant la protéine d'intérêt, celle-ci est extraite du gel puis concentrée sur un disque de PVDF gràce au système ProSorb. Plusieurs lavages après le dépôt de l'échantillon sont ensuite réalisés afin d'éliminer au maximum les contaminants solubles (glycine, SDS, ...) qui pourraient gêner l'identification des premiers résidus. L'identification d'une protéine en solution peut également être réalisée après fixation de celle-ci sur un disque de fibre de verre grâce au Biobrene. Quelle que soit la procédure de préparation, l'échantillon doit être sec avant d'être déposé dans une des cartouches du microséquenceur.

N'hésitez surtout pas à nous contacter pour des conseils concernant la préparation et/ou le conditionnement de vos échantillons.


Identification par microséquençage des protéines/peptides:

Microséquençage N-terminale:

Le microséquençage Nt par dégradation d'Edman donne de très bons résultats et permet d'identifier dans la majoritè des cas la protéine d'intérêt en comparant la séquence Nt obtenue avec les banques de données. Cependant, l'analyse est plus problèmatique lorsque la protéine est bloquée en Nt en raison par exemple d'acétylation, de formylation ou de la présence d'un acide pyroglutamique. Le microséquençage par dégradation d'Edman est alors impossible. Selon le groupement chimique bloquant, il est néanmoins possible de déterminer la séquence Nt de la protéine en réalisant au préalable un déblocage. Au sein de notre service, nous avons ainsi mis au point les protocoles de déblocage d'acétylation et de l'acide pyroglutamique.

Microséquençage interne:

Le microséquençage interne est souvent réalisé pour l'identification de protéines bloquées en Nt (dont le déblocage est impossible) mais il est également très utile pour obtenir des informations complémentaires sur une protéine dèjà identifiée. Pour cela, nous réalisons un essai sur "MicroBlotter" qui permet de purifier les différents peptides obtenus après digestion de la protéine afin de déterminer une ou plusieurs séquences internes de la protéine d'intérêt.

Microsequençage interne

La protéine bloquée subit une digestion enzymatique (ex.: trypsine - protéinase V8) ou une digestion chimique (ex. : bromure de cyanogène). Les fragments peptidiques issus de la digestion sont alors injectés dans le MicroBlotter qui est une HPLC capillaire. La sortie du capillaire est montée sur un solénoïde situé en haut de l'appareil qui permet de déposer les fractions résultant de la chromatographie sur une bande de PVDF et le chromatogramme sort simultanément sur papier grâce à un enregistreur. Après avoir fait des repères sur le chromatogramme et sur la membrane de PVDF, ceux-ci sont superposés et un morceau de membrane est découpée dans une zone située en face d'un pic chromatographique. Le morceau de membrane est alors mis dans le microséquenceur afin d'obtenir non pas une séquence pour l'extrémité Nt mais pour une partie interne de la protéine qui sera comparée aux banques de données.



Identification protéique après digestion trypsique et analyse MALDI-TOF:

Digestion trypsique

Une autre technique d'identification protéique est l'identification par spectrométrie de masse MALDI-TOF. Cette technique est assez précise et sensible pour permettre de travailler avec de très faibles quantités de protéines (de l'ordre de la picomole voire de la fentomole) et permet également de travailler à partir du spot coloré sur gel au bleu de Coomassie ou à l'argent, ce qui représente un aspect pratique appréciable. Le morceau de gel contenant le spot protéique d'intérêt est découpé et transféré dans un tube Eppendorf. Un morceau de gel sans protéine est également découpé et sera utilisé comme témoin. Les morceaux de gel subissent ensuite différents lavages puis une déshydratation permettant de promouvoir la pénétration de la trypsine pour favoriser la digestion.Spectre Maldi ToF Les peptides issues de la digestion sont ensuite extraits, concentrés puis dessalés et analysés au spectromètre de masse (TOFSpecE, Micromass, Manchester UL) du service de spectrométrie de masse de l'IRCOF (Institut de Recherche en Chimie Organique Fine) localisé sur le campus de Mont-Saint-Aignan et accessible pour notre service.

Les pics communs entre les spectres du témoin et de la protéine étudiée (pics résultant de l'autolyse de la trypsine et/ou de la présence de contaminants dans le gel) ne sont pas pris en compte pour l'analyse. En ce qui concerne les autres pics, la valeur de chaque pic (masse monoisotopique) est retenue et une recherche d'homologie avec les spectres (théoriques et/ou hypothétiques) présents dans les banques de données est réalisée par le biais des outils bio-informatiques tels que Protein Prospector et Mascott.



Laboratoires faisant appel à nos services:

Laboratoires de l'IRIB:

Laboratoires Externes:

Nationaux

Internationaux



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